Realizamos un estudio clínico retrospectivo con muestras de plasma de 28 pacientes con FRA obtenidas del Biobanco del Hospital Universitario Ramón y Cajal-IRYCIS (Registro Nacional de Biobancos B.0000678, Madrid) integrado en la plataforma de Biobancos y Biomodelos del ISCIII (PT20/00045). Estudiamos la evolución del FRA en el momento de la admisión en el hospital, y tras 24 y 72h. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado. Los criterios de inclusión en el estudio fueron: 1) ser mayor de 18 años, y 2) haber sido diagnosticados de FRA en el momento del ingreso hospitalario. Los criterios de exclusión fueron: 1) ser menor de 18 años, 2) embarazo o 3) no tener el consentimiento informado. El tipo de FRA fue diagnosticado y clasificado según las guías AKIN (Acute Kidney Injury Network)16,17. Los datos demográficos y clínicos, así como la presencia de comorbilidades, fueron recogidos en las primeras 24h de ingreso en el hospital para el cálculo del APACHE (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation) II score18. Las muestras controles correspondieron a un total de 26 individuos sanos sin ninguna patología procedentes también del Biobanco del Hospital Universitario Ramón y Cajal-IRYCIS. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario 12 de Octubre y se realizó siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki.

Las muestras de sangre de los pacientes fueron recogidas y procesadas en el momento de la admisión hospitalaria, y tras 24 y 72h desde el ingreso. Se obtuvieron las muestras de plasma tras centrifugar la sangre a 2000r.p.m. durante 10min a 4°C y fueron almacenadas a −80°C en el Biobanco del Hospital Universitario Ramón y Cajal-IRYCIS. El Departamento de Bioquímica del Hospital Universitario Ramón y Cajal analizó los principales parámetros de laboratorio relacionados con la función renal utilizados en la práctica clínica habitual, como los niveles de creatinina sérica (sCreat), urea y tasa de filtrado glomerular estimada (TFGe). Se realizaron diferentes análisis de correlación entra las distintas variables de función renal, los parámetros del metabolismo mineral y la citoquina IL-6 en los tres tiempos del estudio. Además, se analizaron todas las variables en función de si los pacientes sobrevivieron (no exitus) o fallecieron (exitus). Mediante kits comerciales de ensayos de inmunoabsorción de ligando a enzimas (ELISA) se determinaron los niveles plasmáticos de la citoquina proinflamatoria IL-6 (ProcartaPlex™ Kit, Invitrogen, París, Francia), FGF23 C-terminal (cFGF23, ELISA, Immutopics, San Clemente, CA) y α-klotho soluble (ELISA, IBL, Fujioka-Shi, Japón).

Para el estudio experimental, se emplearon ratones macho adultos C57BL/6J (cepa silvestre o wild type, WT) procedentes de los laboratorios Charles River International Inc. (Wilmington, MA) de 12-14 semanas de edad. El FRA se indujo mediante una única inyección intraperitoneal de ácido fólico (AF, 250mg/kg, Sigma-Aldrich, Sant Louis,) disuelto en 0,3M de NaHCO3; a los ratones control se les administró 0,3M de NaHCO3 como vehículo19. Se extrajeron muestras de plasma de los diferentes grupos experimentales tras las 24 y 72h desde la inyección del AF. También se utilizaron ratones transgénicos que sobreexpresan la proteína klotho (ratones Tg-Kl; EFmKl46), cedidos por el Dr. Kuro-O (Jichi Medical University, Japón). Estos ratones son capaces de sobreexpresar la forma transmembrana de klotho de forma ubicua gracias a la inserción del promotor del factor de elongación 1-α humano (EFmKl)20. A los ratones Tg-Kl se les sometió al mismo procedimiento experimental que a los ratones WT para la inducción del FRA y se obtuvieron las muestras de plasma a los mismos tiempos. Los estudios con animales se realizaron siguiendo las Directrices para el Cuidado Ético de Animales de Experimentación de la Unión Europea (2010/63/UE) y fueron aprobados por el Comité Bioético de la Universidad Autónoma de Madrid y por la Dirección General de Agricultura y Medio Ambiente de la Consejería de Medio Ambiente de la Comunidad de Madrid (PROEX 186.5/20).

Los valores plasmáticos de cFGF23 y la IL-6 se analizaron mediante kits de ELISA siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Para la cuantificación de cFGF23 se empleó el kit de ELISA de Immunotopics, Inc. (San Clemente, CA), y los niveles de IL-6 se analizaron con el kit de ProcartaPlex™ (Invitrogen, París, Francia).

Para determinar si los datos siguen una distribución normal se realizó el test de Kolmogorov-Smirnov. Las diferencias entre variables paramétricas se analizaron mediante el test t de Student o el análisis ANOVA de una vía con el test de Newman-Keuls. El cálculo de la probabilidad de mortalidad de los pacientes con FRA en función de la concentración plasmática de la citoquina IL-6 se realizó mediante el cálculo del área bajo la curva (ABC) empleando el análisis ROC (receiver operating characteristic curve). El valor óptimo de corte o cut-off a partir del cual la concentración plasmática de IL-6 discrimina entre los pacientes que sobrevivieron frente a los que no, se obtuvo a partir del cálculo del índice de Youden21. Las diferentes correlaciones entre las variables se calcularon con el coeficiente de correlación de Pearson. Para el análisis estadístico de los datos se usaron los softwares GraphPad Prism v8.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) y el SPSS Statistics v22 (IBM, Armonk, NY). Los datos se representan como la media±desviación estándar en el estudio clínico, y la media±error estándar en el estudio experimental. La significación estadística se consideró para valores de p<0,05.

De la cohorte de 28 pacientes con FRA, el 75% (21) eran hombres con una edad media de 64,3±16,1 años. Según los criterios AKIN de diagnóstico y clasificación de los estadios del FRA, del total de los pacientes, el 8,7% se encontraban en estadio 1, el 17,4% en estadio 2, y el 73,9% en estadio 3. Las causas del FRA fueron: necrosis tubular aguda (19), prerrenal (7), glomerulonefritis aguda (1) y nefritis aguda túbulo-intersticial (1). Del total de los pacientes, 6 fallecieron (21,4%). En la tabla 1 se muestran los resultados de los parámetros bioquímicos de acuerdo con la función renal, la concentración de biomarcadores relacionados con el metabolismo mineral de los pacientes con FRA en los tres tiempos de estudio, así como los valores obtenidos en el grupo de individuos control. Todos los pacientes, independientemente del momento, presentaron una TFGe inferior a 60mL/min/1,73m2 tras el FRA, aumentando de forma progresiva y significativa tras 72h post-FRA respecto al momento de la admisión hospitalaria y respecto 24h post-FRA (p<0,001). Tanto la creatinina sérica (sCreat) como la urea presentaban los valores más altos en el momento de la admisión hospitalaria, disminuyendo significativamente a las 72h (p<0,05 vs. admisión, p<0,05 vs. 24h post-FRA en el caso de la creatinina sérica). Tras 72h desde el ingreso, se produjo también una mejora del aclaramiento de creatinina comparado con el momento de la admisión (p<0,01). En la figura suplementaria 1 se muestran los resultados correspondientes a los parámetros analizados de función renal separando entre los pacientes que sobrevivieron frente a aquellos que no. Obtuvimos que la creatinina sérica disminuyó significativamente entre la admisión y 72h en los pacientes que sobrevivieron, mientras que no se observaron cambios en aquellos que fallecieron. En relación con la urea, en el grupo de supervivientes se produjo el descenso significativo tras las 72h. En cambio, en el grupo de no supervivientes, los valores de urea se mantuvieron elevados significativamente respecto al grupo de supervivientes tras las 72h. Por último, en relación con la TFGe, en los supervivientes aumentó tras las 72h, mientras que en los no supervivientes no hubo cambios. En relación con los marcadores del metabolismo mineral, al comparar con los valores de referencia del grupo control, obtuvimos la elevación significativa de cFGF23 en los tres tiempos estudio (p<0,001 vs. admisión, p<0,01 vs. 24h post-FRA y p<0,05 vs. 72h post-FRA), así como la disminución significativa de klotho (p<0,001 vs. admisión, 24h post-FRA y 72h post-FRA). Sin embargo, no obtuvimos diferencias significativas en los niveles plasmáticos de cFGF23 y klotho entre los tres tiempos de estudio. Estos resultados nos indican una mejoría de la función renal tras las 72h, pero sin cambios aparentes entre los niveles de los marcadores cFGF23 y klotho en el momento de la admisión y a las 24 y 72h post-FRA.

La concentración plasmática de IL-6 fue significativamente más elevada en los pacientes con FRA respecto al grupo de los individuos control en los tres tiempos de estudio, encontrando la mayor concentración de IL-6 circulante en el momento de la admisión hospitalaria (fig. 1A, p<0,001 vs. grupo control). Transcurridas 24 y 72h desde el ingreso, los niveles de IL-6 fueron disminuyendo manteniéndose significativamente elevados comparados con el grupo control de referencia (fig. 1A, p<0,05 vs. grupo control). Cuando comparamos los niveles sistémicos de IL-6 y la evolución de los diferentes parámetros de la función renal medidos en los tiempos postadmisión hospitalaria (sCreat, urea y TFGe), observamos que a medida que mejoraba la función renal con el incremento de la TFGe (fig. 1C), el descenso de la sCreat (fig. 1B) y de la urea (fig. 1D), los niveles de IL-6 también disminuían, indicando una evidente relación entre el daño renal agudo y el incremento de esta citoquina proinflamatoria en el momento del ingreso hospitalario. Se analizaron las correlaciones entre los distintos parámetros de función renal y los niveles de IL-6 a los tres tiempos de estudio, sin obtener correlación significativa entre ellas (datos no mostrados), excepto para el caso de la correlación entre los niveles de urea e IL-6, donde obtuvimos una correlación positiva y significativa tras las 72h (fig. 1E).

Figura 1.

Análisis de los niveles sistémicos de la citoquina proinflamatoria IL-6 en pacientes con FRA y su relación con la función renal. (A) Niveles plasmáticos de IL-6 y su relación con los valores de la creatinina sérica (sCreat) (B), la tasa de filtrado glomerular estimada (TFGe) (C) y la urea (D) en pacientes con FRA en el momento de la admisión en el hospital, tras 24 y 72h desde el ingreso. (E) Correlación entre los niveles sistémicos de IL-6 con la urea 72h post-FRA. *p<0,05, ***p<0,001 vs. control.

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A continuación, analizamos si los niveles plasmáticos de IL-6 variaban entre los pacientes con FRA que sobrevivieron (no exitus) frente a aquellos que finalmente fallecieron (exitus) en los tres tiempos de estudio. En la fig. 2A se muestra que en los pacientes que sobrevivieron, la concentración de IL-6 va disminuyendo desde el momento del ingreso hasta las 72h postingreso, mientras que los pacientes que fallecieron presentaron mayores valores de IL-6 frente a aquellos que sobrevivieron en todos los tiempos, especialmente tras las 72h postingreso (fig. 2A, p<0,05, p<0,01 p<0,001 vs. supervivientes tras la admisión, tras 24 y 72h, respectivamente). Además, los niveles de IL-6 tras las 72h fueron significativamente mayores que los obtenidos en la admisión en aquellos pacientes que fallecieron (fig. 2A, p<0,001 vs. admisión). Por este motivo, analizamos si IL-6 podría ser un buen biomarcador predictor de mortalidad en nuestra cohorte de pacientes con FRA mediante el cálculo del área bajo la curva (ABC) y el análisis de las curvas ROC en los tres momentos del estudio. Cuánto más cercana a uno sea el ABC de un biomarcador, mejor predictor es, consiguiendo obtener un valor de corte o cut-off a partir del cual el biomarcador indicaría una elevada probabilidad de mortalidad. En la fig. 2B se muestran las ABC de la IL-6 en los tres tiempos de estudio de los pacientes con FRA, y en la tabla 2 se describen los valores de las ABC, los intervalos de confianza (IC), los puntos de corte, sensibilidad, especificidad y los valores de p de IL-6 en la admisión y tras 24 y 72h postingreso. Como puede observarse, la IL-6 es capaz de discriminar de forma significativa entre los pacientes con FRA que van a sobrevivir de los que no en los tres tiempos de estudio, alcanzando ya una buena discriminación en el momento de la admisión del paciente al hospital (ABC=0,942; p=0,0013; fig. 2B), y alcanzando una predicción total con valor de uno de ABC tras 72h postingreso en el hospital (fig. 2B, tabla 2, ABC=1,000, IC95%=1,00-1,00, p=0,001). El punto de corte en cuanto a los valores de concentración plasmática de IL-6 que predice la mortalidad es de 78,34pg/mL en el momento de la admisión al hospital y de 41,50pg/mL tras 72h postingreso (tabla 2).

Figura 2.

Niveles de IL-6 en los pacientes que sobrevivieron al FRA frente a los que no y su capacidad predictora de mortalidad. (A) Valores plasmáticos de la citoquina IL-6 en pacientes con FRA que sobrevivieron (no exitus) frente a aquellos que fallecieron (exitus) en el momento de la admisión hospitalaria, tras 24 y 72h desde el diagnóstico del FRA. (B) Curvas ROC para determinar el valor predictivo de mortalidad de la citoquina IL-6 en el momento de la admisión hospitalaria (línea granate), tras 24 (línea roja) y 72h desde el diagnóstico del FRA (línea rosa) (B). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs. su respectivo grupo no exitus según el tiempo de estudio.

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En nuestra cohorte de pacientes observamos previamente (tabla 1) el descenso de los niveles sistémicos de klotho tras el momento de la admisión del paciente con FRA al hospital. Por este motivo, estudiamos su relación con los niveles de IL-6 en cada tiempo analizado. Así, obtuvimos que se producía un fuerte descenso de la concentración plasmática de klotho respecto al grupo de individuos sanos en el momento de la admisión hospitalaria, que coincidía con la mayor concentración de IL-6 observada en los pacientes con FRA (fig. 3A). Por el contrario, los niveles circulantes de cFGF23 aumentaron, obteniendo su pico máximo en el momento de la admisión, coincidiendo con los valores máximos observados para la IL-6. Ambos biomarcadores disminuyeron tras las 24 y 72h post-FRA (fig. 3B). Analizamos las correlaciones entre esta citoquina con los marcadores del metabolismo mineral, klotho y cFGF23, medidos en los tres tiempos del estudio. No hubo correlación entre IL-6 con los niveles de klotho (fig. 3C, E y G). Sin embargo, sí existió una correlación significativa y positiva entre la concentración de cFGF23 e IL-6 en todos los tiempos analizados, admisión y tras 24 y 72h (fig. 3D, F y H).

Figura 3.

Relación entre los niveles de IL-6 con los marcadores de metabolismo mineral cFGF23 y klotho en los pacientes con FRA. Relación entre la concentración plasmática de la citoquina IL-6 y la concentración sistémica de klotho (A) y de cFGF23 (B). Correlaciones entre los niveles sistémicos de IL-6 con klotho en la admisión (C), tras 24h (E) y 72h desde el FRA (G), y con cFGF23 en la admisión (D), tras 24h (F) y 72h desde el FRA (H).

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Dado que en las muestras de los pacientes con FRA obtuvimos el descenso de los niveles plasmáticos de klotho en comparación con el grupo control, quisimos estudiar en un modelo experimental murino de FRA nefrotóxico, inducido por la inyección de ácido fólico, si la sobreexpresión de klotho podía prevenir el aumento de IL-6. En primer lugar, analizamos la concentración en plasma de IL-6 tanto en ratones WT como en la cepa de ratones transgénicos que sobreexpresan klotho (Tg-Kl), tras 24 y 72h postinducción del FRA. Como obtuvimos una correlación positiva y significativa entre los niveles de cFGF23 y la IL-6 en los pacientes con FRA en el momento de la admisión hospitalaria (fig. 3D), así como tras 24 y 72h (fig. 3F y H), analizamos los niveles de cFGF23 en todos los grupos experimentales. Así, observamos que cFGF23 aumentó significativamente tras las 24h desde la inducción del FRA (fig. 4A, p<0,001), manteniéndose, aunque más baja, también significativamente elevada tras las 72h post-FRA en los ratones WT (fig. 4A, p<0,05). Sin embargo, en los ratones Tg-Kl con FRA, cFGF23 no aumentó, siendo significativamente menor que los encontrados en los ratones WT tras 24h post-FRA (fig. 4A, p<0,001). Obtuvimos el mismo patrón para los niveles circulantes de IL-6 en ratón, con un incremento significativo de IL-6 en los ratones WT tras 24h desde el daño renal (fig. 4B, p<0,001), disminuyendo tras 72h, mientras que en los ratones Tg-Kl, IL-6 no aumentó de forma significativa, y además sus niveles fueron significativamente menores que los encontrados en los ratones WT 24h post-FRA (fig. 4B, p<0,001). De forma global, en la figura 4C se representa la comparación entre los niveles de IL-6 y cFGF23 en las dos cepas de ratones con FRA con y sin sobreexpresión de klotho, donde además parece que la sobreexpresión de klotho protege del incremento sistémico inducido por el FRA de ambas moléculas.

Figura 4.

Relación entre los niveles de IL-6 y cFGF23 en ratones con FRA inducido en ratones WT y ratones con sobreexpresión génica de klotho Tg-Kl. Niveles plasmáticos de cFGF23 (A) y de la citoquina IL-6 (B) en ratones WT y ratones que sobreexpresan klotho (Tg-Kl) tras 24 y 72h desde la inducción del FRA. (C) Relación entre la citoquina IL-6 y cFGF23 en los ratones WT y Tg-Kl tras las 24 y 72h desde la inducción del FRA (C). *p<0,05, ***p<0,001 vs. vehículo WT; ###p<0,001 vs. grupo WT con 24h post-FRA.

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