Se incluyeron los pacientes procedentes de los hospitales de la Región de Murcia que cuentan con servicio de Nefrología, a los que se les realizó un estudio genético desde el inicio de la implementación de un panel de NGS de ERH en el CBGC (septiembre de 2018) hasta diciembre de 2021.

Familiares de casos índices diagnosticados, en los que solo se realizó secuenciación Sanger de la variante familiar.

Pacientes que firmaron su negativa al uso de sus datos de forma anónima en estudios de investigación, dentro del consentimiento informado de realización de la prueba genética (se adjunta).

Se recogieron los datos clínicos de edad en el momento de diagnóstico genético, antecedentes familiares (contexto familiar general, número de familiares con clínica renal, número de familiares que han llegado a terapia renal sustitutiva [TRS]), alteraciones oftalmológicas o auditivas (hipoacusia global e hipoacusia con caída en tonos agudos), antecedentes de realización de biopsia renal y sus resultados, tamaño renal en ecografía y presencia de quistes renales.

Se recogieron variables analíticas en el momento del estudio genético: presencia de hematuria y cuantificación en hematíes por campo (H/C), creatinina (Cr) sérica, filtrado glomerular estimado (FGe) según la fórmula Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI)17 o la fórmula Schwartz bedside en edad pediátrica18, cociente de albúmina/creatinina (CAC).

A lo largo de este estudio se emplearon dos paneles de captura de diseño Agilent, que incluían sondas específicas para genes relacionados con las ERH más frecuentes. La preparación de librerías se realizó mediante los kits comerciales SureSelect QXT® o SureSelect XT HS® (Agilent Technologies) y la posterior secuenciación en un equipo MiSeq (Illumina). El primer panel, utilizado hasta marzo de 2021, incluía los genes de ERH: COL4A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, PKD1, PKD2, PKHD1, HNF1B. El segundo panel, usado desde marzo de 2021, amplió el número de genes asociados a ERH, añadiendo al anterior los genes MYH9,DNAJB11, GANAB, DZIP1L, UMOD, REN, ACE, AGT, AGTR1, NPHP1 y GLA. Estos paneles incluían además otros genes asociados a otras enfermedades genéticas no relacionados con ERH.

El tipo de panel empleado fue conocido y evaluado por la unidad multidisciplinar a la hora de esclarecer el diagnóstico. Para el filtrado, anotación y análisis de variantes se empleó el software bioinformático Alissa Interpret (Agilent Technologies). La interpretación de las variantes identificadas se realizó de acuerdo con las Directrices del Colegio Americano de Genética Médica y Genómica19 y se informaron solamente las variantes patogénicas, probablemente patogénicas y de significado clínico incierto. La confirmación y segregación familiar de dichas variantes se realizó mediante secuenciación Sanger (Abi Prism 3130, Sequencing Analysis Software 6, Applied Biosystems). Ante un resultado negativo con alta sospecha de ERH, se realizó MLPA (para la identificación de posibles variantes en el número de copia), panel de NGS ampliado20 o exoma clínico. Estos dos últimos tipos de estudios genéticos se realizaron en un laboratorio externo.

Las variables cualitativas se describieron mediante frecuencia y porcentajes, y las cuantitativas mediante media y desviación estándar. La comparación de características clínicas entre los grupos de pacientes se realizó mediante el test chi-cuadrado para las variables cualitativas. En el caso de las variables cuantitativas se aplicó el test t de Student para aquellas con distribución normal o test no paramétricos para datos distribución no normal. La correlación de Spearman se utilizó para analizar la correlación entre medidas paramétricas y no paramétricas. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS® versión 22. Se consideró estadísticamente significativo un valor p<0,05.

Durante 3 años y 3 meses de actividad, se han estudiado un total de 360 pacientes con el panel de NGS. Se han detectado variantes genéticas en 164 pacientes (45,6%) no relacionados familiarmente (tabla 1 y fig. 1).

Figura 1.

Variantes encontradas en pacientes estudiados con sospecha de ERH.

(0,26MB).

En 108 pacientes (30,0%) se identificaron variantes patogénicas o probable patogénicas en genes asociados a ERH. De ellos, 55 variantes se encontraban en genes asociados a SA (32 pacientes con variantes monoalélicas en COL4A4, 10 monoalélicas en COL4A3, 4 monoalélicas en COL4A5, 4 digénicas en COL4A3/4, 3 con dos variantes en COL4A4, 2 con dos variantes en COL4A3), 47 en genes asociados a EPQAD (39 PKD1, 8 PKD2), 4 en el gen COL4A1 (asociado a síndrome de hematuria familiar autosómica dominante con tortuosidad arteriolar retiniana y –contracturas– HANAC), 1 en homocigosis en el gen PKHD1, asociado a poliquistosis autosómica recesiva - PQAR), 1 en TSC1 (asociado a esclerosis tuberosa (tabla 1 y fig. 1).

Se hallaron en total 45 variantes de significado clínico incierto (VSCI) que precisaron estudio de cosegregación de la variante familiar. En 11 de ellas este estudio no fue posible, dada la escasa informatividad de algunas familias. En 6 se observó que la variante cosegregaba con los signos clínicos renales, por lo que a dichas variantes se les atribuyó un efecto causal de la enfermedad, siendo 4 de ellas en el gen COL4A4 y 1 en PKD1. En otras 6 de las VSCI, el análisis familiar no mostró cosegregación, por lo que estas variantes no se consideraron informativas para la familia, o se reclasificaron como probablemente benignas (1 en COL4A1, 2 en COL4A5, 2 en HNF1B, 1 en PKD1). Las otras 22 VSCI se encuentran pendientes del estudio familiar en el momento de la escritura de este manuscrito.

Por otro lado, se encontraron otras variantes patogénicas o probablemente patogénicas relacionadas con ERH, pero que no correspondían al fenotipo de sospecha, o para las que el paciente era portador heterocigoto para variantes en genes con herencia recesiva: 2 variantes probablemente patogénicas en COL4A1 en dos pacientes con poliquistosis (con variantes también en PKD1), 1 portador de variante patogénica en gen PKHD1, 1 portador de variante patogénica en SLC12A3 (síndrome de Gitelman AR), 1 variante probablemente patogénica en COL4A4 (sin fenotipo familiar de SAAD, precisando estudio familiar), 1 variante probable patogénica en PKD1 en paciente joven sin fenotipo de poliquistosis (lo que obliga a seguimiento y estudio familiar). Se identificaron también VSCI en genes de ERH no relacionados con el fenotipo de sospecha, por lo que, tras el reanálisis del caso clínico no se realizó estudio familiar (41 en PKD1, 11 en PKHD1 en heterocigosis, 4 en PKD2, 3 en COL4A1, 3 en COL4A3, 2 en COL4A4, 2 en HNF1B, 2 en EYA-1, 1 en COL4A5, 1 en SALL1, 1 en GANAB, 1 en MYH9, 1 en heterocigosis en NPHP1, 1 en UMOD, 1 en heterocigosis en ACE). No se encontraros variantes en los genes DNAJB11 ni ALG9.

En aquellos pacientes con panel negativo, pero con sospecha fundada de ERH, se solicitó el panel ampliado de ERH, encontrándose: una variante patogénica en el gen MUC1 (asociado a nefritis intersticial autosómica dominante-NTIAD), una variante probablemente patogénica en gen CFI (asociado a glomerulopatía del complemento), una variante probablemente patogénica en gen SLC7A9 (asociado a cistinuria tipo B) y una VSCI en WT1 (asociado a síndrome nefrótico genético resistente a corticoides, disgenesia gonadal y nefroblastoma).

Debido a que el panel de NGS para ERH contiene también otros genes no relacionados con enfermedad renal y a la ampliación de estudio mediante exoma de algunos pacientes, se pudieron identificar variantes patogénicas incidentales en los siguientes genes: JAG1 (síndrome de Alagille), PTPN11 (síndrome de Noonan), UROD (porfiria cutánea tarda AD), UROS (portador de porfiria eritropoyética congénita AR), BTD (portador heterocigoto de la deficiencia de biotinidasa), COL11A2 (portador de sordera neurosensorial no sindrómica), COL9A2 (displasia epifisaria múltiple por anomalía del colágeno 9 AD), COL21A2 (portador de hiperplasia suprarrenal congénita forma no clásica).

Globalmente, considerando los resultados obtenidos con el panel de NGS realizado en el CBGC y los estudios genómicos ampliados, se consiguió un rendimiento diagnóstico final de ERH del 33,3% (120/360), contando hallazgos incidentales, del 35,6% (128/360).

Se compararon las características clínicas de los pacientes con resultado genético positivo frente a las observadas en los pacientes en los que no se obtuvo resultado.

Se estudiaron un total de 223 pacientes con sospecha de enfermedad relacionada con el colágeno IV. Para el análisis comparativo, se excluyeron los pacientes pendientes de estudio familiar o con resultado final de otra ERH, quedando finalmente 207 pacientes no relacionados. De ellos, 59 (28,5%) tuvieron un resultado genético final positivo con variantes en genes asociados a dicha enfermedad (ampliable hasta 69 –33,3%–, de confirmarse la cosegregación de las VSCI en el estudio familiar). Los pacientes con resultado genético positivo eran en mayor frecuencia mujeres (69,1%), tenían una edad media al diagnóstico de 49,7±14,4 años (sin diferencias significativas con el grupo con resultado negativo). Los pacientes con SA confirmado tenían en mayor proporción microhematuria comparado con los de estudio negativo (91,1% vs. 78,4%, p=0,015). No hubo diferencias en la presencia de proteinuria (64% vs. 58,3%, p=0,0717), CAC medio (533±511mg/g vs. 519±498mg/g, p=0,906) y FGe medio al diagnóstico (71±33ml/min/1,73m2 vs. 81±21ml/min/1,73m2, p=0,463). No hubo tampoco diferencias significativas entre los dos grupos en la existencia de hipoacusia (27,9% vs. 24,5%, p=820), o hipoacusia con caída típica en sonidos agudos (20,6% vs. 14,4%, p=0,129) (teniendo en cuenta que tenían audiometría 104 pacientes), ni en alteraciones oftalmológicas (5,9% vs. 2,2%, p=0,392) (tenían exploración oftalmológica 86 pacientes). No hubo tampoco diferencias en presencia de quistes renales (33,8% vs. 23,2%, p=0,104) ni tampoco comparando entre sí los pacientes con proteinuria y sin proteinuria (0=0,600). Las principales diferencias entre grupos se encontraron en el contexto familiar: el 86,2% de los pacientes con resultado positivo tenían antecedentes familiares de ER, frente a un 44,60% en los pacientes sin resultado final (p=0,001). La media del número de familiares con clínica renal fue de 2,5±1,6 en el primer grupo y 1,6±1,6 en el segundo (p=<0,005), y la media de familiares en TRS fue de 0,7±0,6 y 0,4±0,3, respectivamente (p=0,06). Cinco pacientes sin microhematuria tuvieron diagnóstico genético de SA, todos ellos presentaban albuminuria y, al menos, un familiar de primer grado en TRS.

Se analizaron un total de 28 pacientes con biopsia renal realizada previamente al estudio genético. Dos de ellos contaban con análisis de microscopía electrónica, ambos con membrana basal adelgazada, y en ambos se consiguió un diagnóstico genético de SAAD. Del resto, otros 7 pacientes fueron confirmados genéticamente de SAAD y entre sus biopsias renales mostraban: 1 con glomérulo aparentemente normal, 1 glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GEFS), y 5 con proliferación mesangial (dos de los cuales tenían depósitos de IgA y por tanto estaban diagnosticados de nefropatía mesangial IgA, otro tenía depósitos de IgM y otros dos no tenían depósitos). El resto de la muestra no tenía biopsia renal previa. Observando las indicaciones generales de biopsia renal en el resto de la muestra global, calculamos que en 39 pacientes se pudo evitar una biopsia renal gracias a la obtención de un diagnóstico genético previo.

Se solicitó estudio genético a un total de 101 pacientes por sospecha de PQR. Los criterios para solicitar estudio genético en la EPQAD fueron la duda diagnóstica en los fenotipos no clásicos o atípicos de EPQAD, los casos esporádicos sin antecedentes familiares, los casos en los que tener un diagnóstico de certeza era necesario pero no era definitivo por la prueba de imagen en ese momento (como en un posible donante de vivo joven) o cuando se requería para un adecuado consejo genético reproductivo. De los 101 pacientes, un 49,5% tuvieron un resultado genético concluyente: 40 con variantes en PKD1, 8 en PKD2, 1 en PKHD1 en homocigosis y 1 en COL4A4 (aunque la sospecha inicial fue de poliquistosis). De los pacientes con PQRAD con diagnóstico genético, 64% eran mujeres. El FGe en el momento del diagnóstico fue de 76±34ml/min/1,73m2, el CAC 78±22mg/g, ambos sin diferencias respecto al grupo con diagnóstico genético negativo. Todos los pacientes tenían quistes renales. Entre los pacientes con genética positiva, el tamaño renal era grande (60%) o muy grande (20%), con diferencia respecto a los pacientes sin diagnóstico genético, en los que un 72% tenían tamaño normal (p<0,001). De los 32 pacientes con tamaño renal normal estudiados, 9 confirmaron diagnóstico de PQRAD, teniendo 5 de ellos un contexto familiar claro, pero 4 de ellos sin antecedentes familiares previos, y teniendo todos variantes en gen PKD1, excepto un paciente con una variante en PKD2, en el que sí existía historia familiar de ER. No se detectaron diferencias significativas en la edad al diagnóstico entre el grupo de pacientes con tamaño renal normal y con tamaño renal grande o muy grande (41±21 años vs. 42±16 años, p=0,808). De forma general, el contexto familiar predijo de nuevo un resultado genético positivo: el 80% de los pacientes con confirmación genética tenían un contexto familiar claro, mientras que solo el 44% de los pacientes sin confirmación lo tenían (p<0,001).